Scientific Reports 13권, 기사 번호: 14167(2023) 이 기사 인용
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마이코페놀레이트 모페틸(MMF)은 단백뇨성 신장 질환에 적용되지만 족세포에 미치는 영향의 정확한 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 우리의 이전 시험관 내 실험은 MMF가 Ca2+-액틴 세포골격 축의 복원을 통해 족세포 손상을 개선할 수 있음을 시사했습니다. 이 연구의 목표는 신독성 혈청(NTS) 신염(NTN)에서 MMF 치료 중 족세포 생물학을 특성화하는 것이었습니다. NTN은 3주령 야생형 마우스에서 유도되었습니다. 3일째에는 쥐의 절반을 MMF(100 mg/kgBW/d po)로 일주일 동안 치료했습니다. 10일차에는 사구체의 단백질체 분석과 슬릿 다이어프램의 초고해상도 이미징을 수행했습니다. Ca2+ 농도([Ca2+]i)의 다광자 이미징을 위해 족세포 특이적 Ca2+ 센서를 발현하는 마우스에서 실험 설계를 반복했습니다. MMF는 NTS에 의해 유발된 단백뇨와 초승달 형성을 개선했습니다. 우리는 Ca2+ 신호 전달 및 액틴 세포골격 조절과 관련된 단백질의 풍부함에 있어 중요한 변화를 확인했으며, 이는 MMF 치료 후 감소된 Ca2+ 수준을 보여주는 족세포의 직접 [Ca2+]i 영상화에 의해 추가로 확인되었습니다. 이는 족세포 발 돌기 구조의 복원 경향과 관련이 있습니다. 여기서 우리는 MPA가 족세포에 상당한 직접적인 영향을 미친다는 증거를 제공합니다. MMF는 [Ca2+]i의 개선과 족세포의 무질서한 액틴 세포골격의 개선에 기여합니다. 이러한 데이터는 가능한 부작용을 최소화하면서 단백성 사구체병증의 보다 효과적인 치료에 기여할 수 있는 족세포에 대한 면역억제제의 직접적인 효과에 대한 지식을 확장합니다.
사구체병증은 전세계 만성 신장 질환 아동의 5~14%, 신부전 아동의 15~29%를 차지합니다1. 사구체병증이 있는 많은 환자는 장기간 스테로이드 치료를 통해서만 완화 상태를 유지할 수 있습니다. 그러나 이 약을 장기간 사용하면 심각한 부작용이 나타난다. 따라서 특히 소아과 의사들은 이러한 취약한 집단을 대상으로 마이코페놀레이트 모페틸(MMF)과 같은 스테로이드를 절약하는 대체 치료 옵션을 조사해 왔습니다2.
생물학적 활성 마이코페놀산(MPA)의 전구 약물인 MMF는 증식하는 림프구에서 새로운 퓨린 생합성의 주요 효소인 IMPDH의 강력하고 가역적인 억제제 역할을 하여 세포 매개 면역 반응과 항체 형성을 억제합니다3. MMF의 신장 효과에 대한 첫 번째 연구에서는 사구체의 접착 분자와 사이토카인의 발현을 감소시켜 사구체경화증을 예방함으로써 만성 동종이식 거부반응을 예방하는 것으로 나타났습니다4. 지난 20년 동안 MMF는 염증성 사구체병증5에도 확립되어 널리 사용되었습니다.
잘 특성화된 면역억제 효과 외에도 MMF가 신장 조직, 특히 족세포에 어떻게 직접적으로 작용하는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다6,7. 당뇨병성 신증에서는 MMF 처리군에서 족세포의 세포사멸 속도가 낮고 네프린과 포도신의 발현이 보존된 것으로 관찰되었습니다8. 이는 IMPDH의 억제가 네프린과 시냅토포딘 발현을 유지하고 액틴 세포골격을 안정화시키는 ATP 풀을 복원한 퓨로마이신 모델의 결과와 일치합니다9. 또한, Fu et al. 면역 매개 신장 질환에서 MMF의 직접적인 효과를 보여주었습니다. MRL/lpr 마우스를 MMF로 치료했습니다. 그 후, 분리된 신장 피질에서 수행된 RNA 시퀀싱은 활성화될 때 생리적 스트레스 섬유 형성을 방해하는 Rac1 유전자 발현의 상당한 감소를 보여주었습니다. 이에 맞춰 MPA 처리된 족세포 세포주의 RNA 시퀀싱을 수행한 이전의 시험관 내 실험에서는 "액틴 세포골격" 및 "작은 GTPase 매개 신호 전달 조절"이라는 용어가 축적된 것으로 나타났습니다. 또한 "칼슘 채널 활동" 및 "칼슘 이온 수송"이라는 용어도 강화되었습니다11. 족세포의 세포내 칼슘 농도([Ca2+]i)의 증가는 액틴 세포골격의 급성 재구성 또는 심지어 세포골격 붕괴 및 단백뇨로 이어질 수 있습니다. 현재 연구에서 우리는 MMF가 신독성 혈청 신염(NTN)의 생체 내 모델에서 Ca2+-액틴 세포골격 축의 복원을 통해 족세포 손상을 개선할 수 있는지 확인하고 싶었습니다.
10 years) in our vivarium. All animal experiments were performed in accordance with relevant guidelines and regulations provided by the LANUV NRW (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen/State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection North Rhine-Westphalia). The experimental protocol was examined and approved by the LANUV NRW (VSG81-02.04.2020.A052), which adhered to the 3R principles. Each mouse was considered as n = 1. Altogether 13 mice (5 females, 8 males) constituted the control group, 11 mice (7 females, 4 males) the NTS + veh group and 12 mice (7 females, 5 males) the NTS + MMF group. NTN was induced in three-week old mice (nephrogenesis is already completed, but they are not yet sexually mature) as follows: The animals received intraperitoneal injection of nephrotoxic serum (NTS; Probetex, San Antonio, USA) in a dose of 10 µl/g body weight (BW) on two consecutive days. From a pathogenic point of view, the historically coined term “nephrotoxic” is misleading since the serum induces an immune-mediated process. In detail, nephrotoxic antibodies (heterologous sheep antibodies raised against rat whole glomeruli) are deposited in the whole glomerulus including the subepithelial, subendothelial areas as well as mesangium. Subsequently, mesangial proliferation and crescent formation can be observed. Thus NTN serves as a model for immune-mediated glomerulopathy with proteinuria (Fig. 1a). In our study, all NTS-injected mice showed proteinuria on day 3. Mice without NTS induction served as control. Confounders were not controlled. On day 3, either water (NTS + veh) or MMF (Roche, Mannheim, Germany) in a dose of 100 mg/kgBW/d (NTS + MMF) were administered per oral gavage for seven days. They were then anesthetized with ketamine and xylazine followed by cardiac blood sampling and sacrificed by cardiac perfusion with cold phosphate-buffered saline (PBS). Depending on the further examination technique, mice were additionally perfused with 4% paraformaldehyde. The kidneys were removed and either put in melted agarose for acute kidney slices (AKS) or in 4% neutral buffered formalin for stimulated emission depletion (STED) imaging. Spot urine samples were taken before injection with NTS, on day 3 and the last day. The experimental design is depicted in Fig. 1b./p> 1.5) when comparing NTS + MMF with NTS groups. To clarify molecular functions and biological processes affected by MMF-regulated proteins, we performed Gene Ontology (GO) analyses. Figure 3 depicts a selection of significant GO terms. From the enrichment analysis, we could outline two major groups of terms that were of particular interest: Ca2+ signaling and regulation of actin cytoskeleton (Fig. 3a, b). Of the numerous identified proteins with a p value < 0.05 (Supp. Table 3), we analyzed the ones related to Ca2+ signaling and/or actin cytoskeleton regulation displayed as a heat map (Fig. 4a, b). Additionally, the distribution of the most relevant proteins for Ca2+ signaling and actin cytoskeleton regulation are shown in volcano plot (Fig. 4c). For Ca2+signaling, two proteins attracted our interest (Supp. Table 3). Wbp2, which leads to Ca2+ influx from the ER into the cytoplasm. In addition, Stim2, which is responsible for the Ca2+ influx from the extracellular into the intracellular fluid. Both were significantly down-regulated in NTS + MMF mice compared to NTS + veh group. In line with that, we detected significant changes in the expression of Ca2+-dependent proteins such as Cpne1, Cpne4, Cpne8, Fbln1, Fbln2 and Rasgrp2 (Supp. Table 3). Another group of altered proteins was involved in the regulation of the actin cytoskeleton. The protein expression level of several positive regulators for the Rac1 such as Micall2, Dock7, Trio and Fgd5 were highly down-regulated in NTS + MMF vs. NTS + veh group (Supp. Table 3). The significant reduction in the expression level of the down-stream protein Wasf2 also points in this direction (Supp. Table 3). Additionally, we found the expression level of Arhgap29, a positive regulator for RhoA, highly up-regulated (Supp. Table 3). It was in line with the increased protein level of Spn and Eif5a, which are known to promote stress fiber formation (Supp. Table 3). Finally, we observed a decreased expression level of the lamellipodia inducing Shank3 (Supp. Table 3)./p>|0.58|) altered proteins from the glomeruli proteome analysed using the ShinyGo Gene Ontology (GO) Enrichment Analysis. Panel (a) shows the comparison between NTS and control mice (NTS effect). Panel (b) shows the comparison between NTS + MMF and NTS + veh mice (therapy effect). On the left: the lollipop graphic of altered GO Molecular Functions; on the right: network analysis of the altered GO Molecular Functions. Controls n = 4; NTS + veh n = 4; NTS + MMF n = 6; NTS: nephrotoxic serum; MMF: mycophenolate mofetil./p>
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